新国标GB/T 5750-2023扩项，为何我做的丙烯酰胺回收率这么低！Anavo产品来帮忙……

       丙烯酰胺作为具有神经、生殖、发育毒性，容易致癌，已被国家癌症中心 (IARC)列为ⅡA类致癌物，在最新颁布的GB/T 5750-2023《生活饮用水标准检验方法》对丙烯酰胺的测定方法进行了拓展，在2006版气相色谱法的基础上，新增了高效液相色谱串联质谱法。

GB/T 5750.8-2023 (13)丙烯酰胺的测定，第一法（新增高效液相色谱串联质谱法）相比第二法（气相色谱法）的优势：

• 高效液相色谱串联质谱法与气相色谱法相比，采用活性炭固相萃取柱进行样品富集、净化，代替传统的液液萃取方式。

  
  

• 其次，无需样品的溴化反应过程，减少了硫酸等复杂溶剂的使用。

丙烯酰胺液质法扩项的挑战

       基于以上液质法的优势，新国标GB/T 5750-2023扩项过程中，越来越多的检测工作者采用了新增的液质法进行饮用水中丙烯酰胺的测定。不过，我们收到很多检测工作者的反馈，在扩项过程中遇到了以下挑战：

挑战1：由于丙烯酰胺的强极性，目前市面上提供的大部分前处理产品（包括进口），在大量上样后出现了丙烯酰胺的穿透现象，在小柱上几乎没有保留。因此，从水中萃取丙烯酰胺存在较大挑战。

挑战2：由于丙烯酰胺易溶于水，属强极性化合物，在传统的反相色谱柱上保留较弱。

Anavo产品来帮忙

纳鸥科技技术团队，采用Anavo AC SPE小柱作为萃取填料（500 mg/6 mL ,PN: AN60C059）净化和富集水样，对水中的高极性化合物丙烯酰胺具有极强的吸附能力。在色谱分离方面，使用Anavo HSS T3色谱柱（2.1*50 mm, 1.8 μm，PN：AN80A058），对丙烯酰胺具有优异分离效果。

Anavo AC SPE小柱前处理过程：

前处理过程关键点&注意事项：

（1）在SPE装置上用截止阀（考克）控制流速，1滴/秒或者3滴/2秒。

（2）甲醇洗脱的时候慢一点，控制流速，0.5-1 mL/min洗脱液收集后加入1 mL水，40 ℃下缓慢通入氮气吹至约1 mL，再上机。

结果表明, 丙烯酰胺加标浓度0.05 μg/L，回收率96.6% ~106.0%，相对标准偏差RSD=3.7%；丙烯酰胺加标浓度0.1 μg/L，回收率94.7% ~102.9%，相对标准偏差RSD=3.0%；丙烯酰胺加标浓度0.5 μg/L，回收率96.5% ~103.8%，相对标准偏差RSD=2.3%。

具体实验流程

生活饮用水中丙烯酰胺测定

1 方法原理

水样通过活性炭固相萃取柱净化和富集，甲醇洗脱液经浓缩、定容和过滤后，采用液相色谱分离，串联质谱检测，同位素内标法定量。取100 mL水样经提取后定容至1.0 mL测定，最低检测质量浓度为0.02 μg/L。

1.1试剂、材料和仪器设备

1.1.1 甲醇：（色谱纯 纳鸥科技）

1.1.2甲酸：（色谱纯 Aladdin公司）

1.1.3 标准溶液：甲醇中的丙烯酰胺标准溶液（DRE-A10045300ME- 100，德国Dr.E公司，浓度100 mg/L）；丙酮中13C3-丙烯酰胺标准溶液（20128XB，曼哈格公司，浓度100 mg/L）。

1.1.4 固相萃取柱：（AC小柱 500 mg 6 mL，纳鸥科技，PN：AN60C059）

1.1.5 水系微孔滤膜：（RC再生纤维素滤膜 0.22 μm，纳鸥科技，PN：AN40A025）

1.1.6 液相色谱-质谱联用仪（美国waters公司液相色谱质谱联用仪TQ-XS）。

1.1.7 Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）

1.1.8 氮气吹干仪（瑞典Biotage公司）

1.1.9 液相色谱柱（Anavo HSS T3色谱柱：2.1*50 mm, 1.8 μm , 纳鸥科技，PN：AN80A058）

1.2 分析步骤

1.2.1 样品采集

使用棕色玻璃瓶采集水样，水样充满样品瓶并加盖密封，避光0 ℃～4 ℃冷藏保存，保存时间为48 h。

1.2.2 水样的前处理

用5 mL甲醇及5 mL水活化固相萃取柱。取100 mL水样，加入50 μL质量浓度为100 μg/L丙烯酰胺13C3内标使用液，混匀，内标物在水中的质量浓度为0.05 μg/L。水样以1 mL/min过富集柱。用氮气吹2 min，使固相萃取柱干燥，之后用10 mL甲醇洗脱到试管中。洗脱液收集后加入1 mL水，于40 ℃下用氮气吹至1 mL，微孔滤膜过滤，供仪器测定。

1.2.3 标准溶液的配制

1.2.3.1 丙烯酰胺标准中间液：准确移取丙烯酰胺标准溶液（2.2.3）1 mL 至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，浓度为10 mg/L。

1.2.3.2 丙烯酰胺标准使用液：准确移取标准中间液（2.3.2.1）1 mL至100 mL容量瓶中，用纯水定容，浓度为100 μg/L。

1.2.3.3 13C3-丙烯酰胺内标中间液：准确移取13C3-丙烯酰胺内标溶液（2.2.3）1 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇定容，浓度为10 mg/L。

1.2.3.4 13C3-丙烯酰胺内标使用液：准确移取13C3-丙烯酰胺内标中间液（2.3.2.3）1 mL至100 mL容量瓶中，用纯水定容，浓度为100 μg/L。

1.2.3.5 标准系列：丙烯酰胺标准使用液（2.3.2.2）以纯水逐级稀释，配制得到 2 μg/L、5 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L的标准工作液系列。每个浓度的标曲样品加入固定浓度5 μg/L的13C3-丙烯酰胺。

1.2.4 数据处理  

式中：

r——水样中丙烯酰胺的质量浓度，单位为毫克每升（mg/L）;

r1——从标准曲线上得到的丙烯酰胺的质量浓度，单位为微克每升（μg/L）；

V1——样品溶液上机前定容体积，单位为毫升（mL）；

V2——样品溶液所代表试样的体积，数值为100，单位为毫升（mL）；

1000——毫克每升与微克每升的换算系数。

2 实验结果

2.1 定量限和试剂空白

以信噪比（S/N=10）确定目标组分定量限。将2 μg/L的标准溶液按标准方法规定步骤测定。对比试剂空白（超纯水）色谱出峰情况，对目标组分无显著干扰。由于样品经过100倍的富集，由此确定丙烯酰胺的定量限为0.020 μg/L。

2.2 标准曲线

以丙烯酰胺的质量浓度为横坐标，以丙烯酰胺峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标，绘制拟合曲线。丙烯酰胺的拟合曲线方程y=0.524254x+0.430776（r=0.9995）。

2.4回收率和精密度

采用末梢水样品进行加标回收（0.05 μg/L, 0.1 μg/L和0.5 μg/L）和精密度（n=7）实验。结果表明, 丙烯酰胺加标浓度0.05 μg/L，回收率96.6% ~106.0%，相对标准偏差RSD=3.7%；丙烯酰胺加标浓度0.1 μg/L，回收率94.7% ~102.9%，相对标准偏差RSD=3.0%；丙烯酰胺加标浓度0.5 μg/L，回收率96.5% ~103.8%，相对标准偏差RSD=2.3%；

3.典型谱图

水样净化后质谱图（加标浓度0.5 μg/L）

水样净化后质谱图（加标浓度0.1 μg/L）

水样净化后质谱图（加标浓度0.05 μg/L）

丙烯酰胺测定关键耗材