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让血样前处理更简单、更高效,一种儿茶酚胺及代谢物的LC-MS/MS检测方法

发表时间:2024-07-18 10:59

关于儿茶酚胺


儿茶酚胺(Catecholamine, CA )是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质。儿茶酚胺主要包括去甲肾上腺素(NE)、肾上腺素(E)、多巴胺(DA),其代谢物包括变肾上腺素(MN)、去甲变肾上腺素(NMN)以及3-甲氧酪胺儿(3-MT)。


儿茶酚胺的含量与肾上腺髓质瘤密切相关,这些肾上腺髓质瘤会结合大量儿茶酚胺导致循环失常;儿茶酚胺含量过高会引发高血压和心肌梗塞,含量过低则通常导致低血压;另外儿茶酚胺含量水平的不同与心脏猝死、冠状心脏病和心脏不充血等也有潜在联系。准确检测体内儿茶酚胺的含量,在临床上可以用于辅助诊断高血压、甲亢、嗜铬细胞瘤和神经母细胞瘤等内分泌相关疾病


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儿茶酚胺检测难点和痛点


儿茶酚胺及其代谢物的极性较大、结构相近,而且在血浆中含量较低、干扰较大,传统的免疫法不能准确定量,必须采用先进的样品前处理方法和灵敏度更高、选择性更好的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法进行定量分析。

前血样中儿茶酚胺的前处理主要的方法是WCX(弱阳离子)净化法,但WCX净化法具有以下缺点:

1、步骤繁琐,WCX固相萃取净化需要进行活化、平衡、上样、淋洗、洗脱等流程。

2、繁琐的前处理步骤,不利于血样样品的自动化前处理操作。同时,复杂的前处理过程,增加了检测结果的不稳定因素

3、前处理过程耗时、费力,以处理96个样品为例,使用WCX 96孔板净化样品,约需210 min。

创新产品:HMR超效分体96孔板

纳鸥科技(Anavo)聚焦生物样品前处技术,通过技术攻关,创新推出Anavo HMR超效分体96孔板,相比传统儿茶酚胺前处理过程,具有以下优势:


01 更少前处理步骤&时间

Anavo HMR超效分体96孔板,采用新型无机固相萃取材料,可选择性去除复杂基质中脂质,无需经过传统固相萃取柱的活化、淋洗、洗脱等流程,血样可直接上样净化。仅需一步,即可同时在管内完成蛋白沉淀和样品净化。


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下面以处理96个样为例,对两个方法进行对比。

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注:以上前处理时间是在理想状况下进行实验的估算



从以上对比可以看出,传统WCX 96孔板,需要经过预处理样品,小柱的活化、平衡、上样、淋洗、洗脱等繁琐步骤,才能完成样品净化。同时,需配置不同的溶液,以及反复移取不同溶液等,操作费时费力,耗时约210 min(以96个样品为例)。

HMR超效分体96孔板,一步净化法,可同时在管内完成蛋白沉淀和样品净化,耗时仅需50 min(以96个样品为例),净化时间比传统方法缩短了4倍多。极大简化前处理步骤,而且大大节省了宝贵的前处理时间。


02 更少上样量

净化小柱采用阶梯式设计+30 μm小粒径填料,同样质量的填料,更高的柱床和理论塔板数,更优净化效果。同时,更少上样量,特别适用于血清等特别珍贵的生物样本的前处理。

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传统96孔板需上样200 μL以上,HMR超效分体96孔板仅需50 μL,大大节省了宝贵的样品。

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03 更优净化效果

HMR无机固相萃取填料特异性吸附磷脂基团,可消除磷脂带来的基质效应问题。


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一种儿茶酚胺及代谢物的LC-MS/MS检测方法


1、样品前处理

(1) 准确吸取50 µL血清至HMR超效分体96孔板(货号:AN25M006)中,加入同位素内标工作溶液,沿萃取柱内壁缓慢加入200 µL乙腈,通风柜内放置5 min,待溶液通过筛板进入填料中。

(2) 将HMR超效分体96孔板转移至正压装置上,逐步施加压力,将小柱中的液体完全缓慢排出,液体收集至96孔板中。加入200 µL乙腈,重复提取操作一次。收集两次流出液,40 ℃氮气吹至近干,加入50 µL甲醇-水(1:1,v/v)复溶,放置于96孔板涡旋混匀仪混匀1 min,直接上机检测。


前处理注意事项:

1、内标体积太小(50、20微升),稍微有损失,就会影响定量,所以建议先加样品、再加内标,最后加乙腈;

2、加液体过程中,一定注意尽量让移液枪的枪头接近净化管中最上层筛板加液。需要正确使用移液枪,特别是小体积加样时;

3、建议分两次加入乙腈。如果只加一次乙腈,可能洗脱不完全,净化管里有残留。压完一次,加入乙腈,再正压;

4、乙腈:血清的比例从3:1开始优化。


2、色谱条件

色谱柱:Gemsil PFP(1.7 μm, 2.1×100 mm),货号:AN80A095;

流动相:A:0.1%甲酸的水溶液,B:乙腈,

梯度洗脱;见表一

流速:0.4 mL/min;

柱温:45 ℃;

进样体积:5 μL。


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3、质谱条件

电离方式:电喷雾离子源,正离子模式;

检测方式:多反应监测 (MRM);

离子源温度 (TEM): 600℃; 雾化气 (Gas1): 70 psi;辅助气 (Gas2): 70 psi; 气帘气 (Gurtain Gas): 30psi;电喷雾电压:5500V;


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4、方法学参数

向血清样本中加入标准物质,得到1µg/L、5µg/L、10µg/L三种浓度的加标样品。按照上述前处理方法处理样品,上机检测,具体结果见表3.


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5、谱图

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六种化合物总离子流图


方法配套关键耗材

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关于Anavo HMR超效分体96孔板可点击下方链接查看

Anavo®超效分体96孔固相萃取板


纳鸥科技
上海分公司
联系电话:021-6403 2202/133-9125-2363 联系邮箱:info@anavosci.com 联系地址:上海市徐汇区古美路1658号腾骏(创意)园305室
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